Reinigung und Kristallisation der Laktonasen GqqA und QsdR1

Abstract

Rahmen dieser Bachelorarbeit wurden unterschiedliche Vorgehensweisen für die Expression und Reinigung der Laktonasen GqqA und QsdR1 getestet. Weiterhin wurden Ansätze für eine folgende Proteinkristallisation gesucht, welche für eine Struktur-Funktionsanalyse benötigt wird. Das Bearbeiten der Laktonase QsdR1 stellte sich dabei als schwierig heraus. QsdR1 konnte zwar erfolgreich mittels pET21a(+)-Plasmid in den E. coli BL21 (DE3)-Expressionsstamm transformiert werden, wurde jedoch bei einer anschließenden Expression nur in geringen Mengen produziert. Unterschiedliche IPTG Konzentrationen beim Induzieren der Expressionskulturen brachten kein besseres Ergebnis. Eine Reinigung mit diesen niedrigen Mengen an Zielprotein führte zu keinem Erfolg. Die Produktion und Reinigung der Laktonase GqqA war erfolgreicher. Das GqqA-codierende pET21a(+)-Plasmid konnte erfolgreich in den E. coli BL21 (DE3)-Expressionsstamm transformiert werden. Die Expression mit diesem Vektor stellte, durch den C-terminalen 6xHis-tag, für die anschließende Reinigung mittels NiNTA-Matrix einen großen Vorteil dar. Durch einen weiteren Reinigungsschritt mittels der ÄKTA-Größenausschlusschromatographie mit einem K2HPO4-Elutionspuffer pH 5,0 konnte die Laktonase in einer hohen Konzentration über einen Zeitraum von mindestens 60 h ohne signifikanten Stabilitätsverlust gelagert werden. Desweiteren konnten Kristallisationsbedingungen gefunden werden, welche geeignete Kristalle für eine anschließende Strukturanalyse hervorbrachten. Mit einem Blick auf die Ergebnisse dieser Arbeit wird aber auch deutlich, dass einige Vorgehen in Zukunft weiter optimiert werden können. Gerade bei der Laktonase QsdR1 muss der Schritt der Expression hinterfragt werden. Möglicherweise liefern andere Expressionsparameter oder ein anderer Expressionsstamm bessere Ergebnisse. Bei der Laktonase GqqA bedarf es nur noch geringer Optimierung bei der Kristallisation. Hierbei könnten bei der Proteinkristallisation einzelne Parameter weiter untersucht werden. Daraus könnten optimalere Kristalle mit regelmäßiger Form und scharfen Kanten entstehen, welche zu besseren Ergebnissen bei der Röntgenanalyse führen könnten.