Biochemische und chromatographische Untersuchungen zur Kakaofermentation

Abstract

Die essentiellen Schokoladenaromavorstufen werden während der Fermentation durch die Proteolyse der kakaoeigenen Speicherproteine gebildet. Die Speicherproteine beinhalten zu 53 % Albumin und zu 48 % Vicilin. Letzteres besteht aus drei Untereinheiten mit Molekulargewichten von 47 kDa, 31 kDa und 15 kDa. Durch Inkubationsversuche mit Proteinextrakten und frischen Kakaosamen wurde die Steuerbarkeit der Proteolyse untersucht. Peptidspektren, die mittels HPLC erstellt wurden, gaben Aufschluss über den Einfluss des pH-Wertes und der Inkubationsdauer. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass der pH-Wert eine bedeutendere Rolle spielt als die Inkubationsdauer. Dafür sprechen auch die Ergebnisse aus den Messungen der freien Aminosäuren. Diese zeigen, dass bei einem pH-Wert von 3 der Gehalt an freien Aminosäuren um etwa 90 % geringer ist als bei pH 4 oder pH 5. Bei Vorortfermentationen gibt es die Möglichkeit einer Vortrocknung der Kakaosamen. Diese bedingt, dass die Pulpa schneller abfließt. Die Auswirkungen auf die Aromabildung wurden experimentell ermittelt. Die Inkubation von Kakaosamen mit Milchsäure simuliert eine Trocknung der Samen. Dies konnte anhand einer Verschiebung der organischen Säuren belegt werden. Werden die Samen vorgetrocknet, so wird die Fermentation von Milchsäure dominiert. Die Ergebnisse der resultierenden Peptidspektren zeigen, dass eine Vortrocknung zu einem schwächer ausgeprägten Peptidspektrum führt. Da hydrophile Peptide zu den aromarelevanten Vorstufen gehören, sollten davon möglichst viele entstehen. Durch zusätzliche chromatographische Messungen wurde weiterhin bestätigt, dass eine Inkubation in Essigsäure mehr freie Aminosäuren hervorruft als eine Inkubation in Milchsäure. Die hydrophoben Aminosäuren bilden zusammen mit den Peptiden die Grundlage für die aromarelevanten Vorstufen. Der Speicherproteinabbau wird ebenfalls durch eine von Essigsäure dominierende Inkubation der Samen beschleunigt. Diese Ergebnisse sprechen neben den Peptidspektren und der Verschiebung der organischen Säuren gegen eine Vortrocknung der Samen. Massenspektrometrische Untersuchen ergaben eine Anzahl von Peptiden, die während der Inkubation entstanden. Die detektierten Peptide des Albumins deckten 63 % dessen Aminosäure-Sequenz ab. Vom Vicilin wurden 18 % der Sequenz durch detektierte Peptide abgedeckt. Bei der Betrachtung der Spaltungsspezifität der Proteasen wurde deutlich, dass die Spaltungsstellen nicht nur mit den bekannten Mustern, hervorgerufen durch Trypsin, Chymotrypsin und Pepsin, erklärt werden können. Weitere Untersuchungen könnten klären, ob der Aspartylendoproteasetyp TcAP1 oder die Aminopeptidase Einfluss auf das Spaltungsmuster haben.

The essential chocolate flavor precursors are generated during fermentation by proteolysis of the cocoa storage protein. The storage proteins contain 53 % of albumin and 48 % of vicilin. The latter consists of three subunits with molecular weights of 47 kDa, 31 kDa and 15 kDa. Incubations with protein extracts and fresh cocoa seeds indicate the controllability of the proteolysis. Peptide spectra by means of HPLC provide informations about the influence of the pH-value and the incubation length. The results revealed that the cause variable pH-value is more important than the duration of incubation. Due to this, measurements of free amino acids at a pH-value of 3 have shown that the amount is about 90 % lower than at pH-values of 4 or 5. Within the scope of fermentations on-site, there is the possibility of seed-drying before the genuine fermentation has started. This causes a faster drainage of the pulp. The effect on the aroma development was tested. The incubation of cocoa seeds with lactic acid simulated the pre-drying. This was proved by the shift of the organic acid ratio. The fermentation is dominated by lactic acid when the seeds are pre-dried. The results of the peptide spectra have shown that the pre-drying causes a lower spectrum. Since these hydrophilic peptides are one of the relevant aroma precursors, a lot of them should be generated. Additional chromatographic measurements have also shown that an incubation of seeds in acetic acid causes more free amino acids than the incubation in lactic acid. Hydrophobic amino acids and peptides are the basic compounds for the aroma specific precursors. The degradation of the storage protein is accelerated by acetic acid. These results indicate beneath the peptide spectra and the shift of organic acids that a pre-drying is not useful. Mass-spectrometric experiments resulted in a number of peptides which were generated during incubation. The peptides of the albumin covered 63 % of the amino acid sequence and the peptides from the vicilin covered 18 % of those amino acid sequence. The splitting pattern of the proteases intimate, that the known pattern of trypsine, chymotrypsine and pepsin cannot be responsible for all splits. Further experiments on other enzymes like aminopeptidase and TcAP1 could clarify if they have influence on the splitting pattern.