Herstellung und Charakterisierung von Einzeldomänenantikörpern und Nanopartikelkonjugaten für die Visualisierung von Tumorzellen

Abstract

Der epidermale Wachstumsfaktorrezeptor (EGFR), welcher in vielen humanen Tumoren epithelialen Ursprungs überexprimiert ist, repräsentiert einen der wichtigsten Biomarker, die im Zusammenhang mit Krebserkrankungen bekannt sind. Die Identifizierung solcher Tumor-assoziierten Moleküle erfolgt dabei immer mehr auf Grundlage nicht-invasiver Bildgebungsverfahren, wie zum Beispiel der Positronen-Emissions-Computertomographie (PET) und der Einzelphotonen-Emissions- Computertomographie (SPECT). Hierbei kommen derzeitig vorrangig monoklonale Antikörper (mAk) zum Einsatz, die jedoch aufgrund ihrer Molekularmasse eine eher langsame Pharmakokinetik aufweisen. Mit Einzeldomänenantikörpern (sdAb) hingegen können hohe Tumor-zu-Hintergrund-Verhältnisse bereits kurze Zeit nach der Injektion erzielt werden, sodass diese immer mehr in den Fokus neuer Imaging-Strategien rücken. Um den zukünftigen Einsatz der zwei in der Literatur beschriebenen anti-EGFR sdAb EG2 und 7C12 für die multimodale Bildgebung untersuchen zu können, wurden diese im Zytoplasma des E.coli SHuffle T7 Express heterolog exprimiert und mittels immobilisierter Metallchelat-Affinitäts-chromatographie gereinigt. Die Ausbeuten beider sdAb pro Liter Kulturmedium betrugen 25,0 mg EG2 und 4,2 mg 7C12. Zur näheren Charakterisierung der sdAb wurde die korrekte Ausbildung der in den Proteinen enthaltenen Disulfidbrücken untersucht und jeweils die Extinktionskoeffizienten und der Gehalt freier Aminogruppen bestimmt. Für erste Zellbindungsassays wurden die sdAb mit 99mTc und einer radiochemischen Reinheit von über 90 % markiert. Weiterhin wurde gezeigt, dass beide sdAb abhängig vom Expressionslevel des EGFR der verwendeten humanen Krebszelllinien an A431- und FaDu-Zellen binden. Pro A431-Zelle haben bis zu 0,017 fmol 7C12 bzw. 0,005 fmol EG2 gebunden, je FaDu-Zelle bis zu 0,012 fmol 7C12 bzw. 0,002 fmol EG2. Die sdAb wurden an die Oberfläche fluoreszenter PMMANanopartikel (NP) gebunden und die Konjugate anschließend im Vergleich zu den ungebundenen sdAb hinsichtlich ihrer Bindungseigenschaften mittels Immunfluoreszenzfärbung untersucht. 7C12 wurde hauptsächlich membranständig detektiert und zeigte dementsprechend eine Co-Lokalisation mit EGFR. EG2 hingegen wurde intrazellulär in der Nähe des Zellkerns lokalisiert. Erste In-vitro-Untersuchungen zur Bindung der EG2-NP-Konjugate zeigten ebenfalls eine Lokalisation nahe dem Zellkern. Weitere Bindungsstudien mittels konfokaler Mikroskopie und Durchflusszytometrie, vor allem die Untersuchungen der 7C12-NP-Konjugate sind in Planung.

The epidermal growth factor receptor (EGFR), which is overexpressed in a variety of human tumors of epithelial origin, is one of the most important biomarker known in the context of cancer. To identify such tumor-associated molecules noninvasive imaging procedures, e.g. positron emission tomography (PET) and single photon emission computed tomography (SPECT), are of high interest, whereby monoclonal antibodies (mAb) are widely used. However, their large size (150 kDa) leads to liver accumulation and prevents rapid blood clearance. The usage of single-domain antibodies (sdAb) can help to overcome these drawbacks. Because of their smaller size it is possible to achieve high tumor-to-background ratios a short time after injection. To evaluate the application of two anti-EGFR sdAb in multimodal imaging, the sdAb EG2 and 7C12 were expressed heterologously in the cytoplasm of E.coli SHuffle T7 Express. The yields of 7C12 and EG2 purified by immobilized metal affinity chromatography (IMAC) were 4.2 mg and 25.0 mg per liter medium, respectively. The validation of correct folded disulfide bonds and the determination of extinction coefficients and content of free amino groups were performed for further characterization. For the examination of binding features sdAb were radiolabeled with 99mTc with a radiochemical purity of at least 90 %. Both sdAb bound to A431 and FaDu cells depending on their EGFR expression level. One single A431 cell bound up to 0.017 fmol 7C12 or 0.005 fmol EG2, respectively, and one single FaDu cell bound up to 0.012 fmol 7C12 or 0.002 fmol EG2, respectively. The two sdAb were bound to the surface of PMMA nanoparticles (NP) and they were analyzed concerning their binding features. For this purpose immunofluorescent staining was performed to compare sdAb with sdAb-NPconjugates. Membrane localization associated with co-localization with EGFR was shown in the case of 7C12. However, EG2 was found to be localized close to the nucleus of the cells. This was also true for EG2-NP-conjugates. Additional studies of binding by confocal microscopy and flow cytometry, especially the investigation of 7C12-NP-conjugates, remains to be done.